MAT法热原检测中，获得标准 S 型标曲需通过显色时机控制与图形调整实现，确保标曲拟合准确。在显色时机控制上，加入 TMB 底物后，孔内颜色会逐渐变蓝，且随反应时间加深，当标准品浓度梯度呈现明显蓝色差异（如高浓度孔深蓝色、低浓度孔浅蓝色）时，即可加入终止液；若仪器含 600nm 波长，可在终止前检测高浓度标准品的 OD600nm 值，当达到 1.0 左右时终止，此时显色反应处于线性期，终止后颜色由蓝变黄，信号强度约增强 3 倍，易形成 S 型曲线。在图形调整上，若标曲拟合后未呈现明显 S 型，可通过调整坐标轴范围优化—如将纵轴（OD 值）范围设为 0-2.5，横轴（热原浓度）设为对数坐标，突出低浓度区的拐点与高浓度区的平台区，使曲线更接近 S 型。此外，标曲配制需确保浓度点单独配制（非连续稀释），避免高浓度标准品污染低浓度点，导致低浓度区信号异常升高，破坏 S 型曲线形态。通过以上方法，可有效提升 S 型标曲的成功率，保障热原定量的准确性。
中国药典9301已将MAT列为热原检测的补充方法，美国药典鼓励企业采用经过验证的MAT替代家兔法。安徽热原检测技术升级
PyroSHENTEK®热原检测试剂盒突破传统检测方法局限，不仅能检测革兰氏阴性菌来源的内毒素，还可准确识别革兰氏阳性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等产生的非内毒素热原（NEP），契合热原检测 “全风险覆盖” 的法规需求。其定量限低至 0.025EU/mL，实验数据显示，对 Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多种 NEP 均能有效检出，且加标回收率稳定在 50%-200% 合格范围（如贝伐珠单抗注射液中 LTA 加标回收率 66.8%、Zysoman 加标回收率 113%）。此外，试剂盒联合了国内相关机构完成室间验证，与传统家兔热原试验（RPT）桥接结果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）中 LPS 加标回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加标回收率 71.6%，检测数据科学性符合国际法规要求，助力企业无缝衔接中美欧等地申报标准。
重组蛋白热原检测单核细胞活化反应测定法热原检测历经动物整体试验、体外生化反应到细胞免疫应答的三阶段演进，灵敏度与效率不断提升。
MAT法热原检测中，标曲信号值偏低或线性不佳是常见问题，需按细胞、标准品、ELISA 检测三环节排查解决。细胞相关问题中，细胞复苏后若未充分混匀导致结团，种板后细胞分布不均，会使局部信号弱，需振荡细胞悬液后再种板；细胞活性差或处理时间超半小时，会降低炎症因子分泌，需严格按说明书操作并缩短处理时间；孵育未达 37℃、5% CO₂条件，细胞活化不足，需确保培养箱参数稳定；细胞悬液若接触外源热原，会引发非特异性反应，操作时需远离热原污染源。标准品问题方面，配制稀释错误会直接导致浓度不准，需核对稀释步骤；振荡时间不足（未按说明书要求）会使内毒素分散不均，需确保振荡充分且 4 小时内使用；标准品降解会导致效价下降，需按推荐条件保存（如 - 20℃冷冻）。ELISA 检测环节，孵育时间短或振荡速度慢会影响抗体结合，可适当延长孵育或提高振荡速度；TMB 显色不足（<3 分钟）会导致信号低，需显色 3-10 分钟，待高浓度点 OD600 达 1.0 时加终止液。
基于单核细胞系的稳定性，MAT 热原检测可将复孔数从药典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®热原检测试剂盒数据显示，单核细胞系标曲的 4 复孔与 3 复孔，各浓度点（0.0125-1.0EU/mL）的准确度（相对偏差）与精密度均在标准范围内，无明显差异。这一调整的主要依据是单核细胞系消除了 PBMC 的异质性，无需依赖多复孔抵消波动，既能满足热原检测的稳定性与统计学合理性要求，又能减少试剂与耗材消耗，降低检测成本，同时提升实验效率。因此样品预测试时可选择3复孔进行初步检测，产品放行还需按照药典要求进行4复孔测试。
基于人体免疫机制的 MAT 热原检测，为热原检测提供了新的可靠途径。
PBMC（外周血单个核细胞）的复杂制备流程严重制约热原检测效率。首先，血源获取受献血者数量、时间及采集血液政策限制，无法按需即时获取；其次，需严格执行 EP2.6.30 规定的标志物检测，增加前期准备时间；再进行采集血液、分离单核细胞、冻存等环节需全程无菌操作，步骤繁琐且易引入污染风险。相比之下，单核细胞系可工业化培养，制备流程简单可控，能快速提供合格细胞，避免因 PBMC 制备延误热原检测进度，更适配批量样品的高效质控。单核细胞活化反应试验（MAT）利用人源细胞释放IL-6等因子，可同时检出病毒、真菌等非内毒素热原。上海重组蛋白热原检测风险评估
热原有广谱来源特征，革兰阴性菌（内毒素/LPS）致热能力强，革兰阳性菌、真菌、病毒均可产生。安徽热原检测技术升级
PBMC（外周血单个核细胞）用于 MAT 热原检测时，存在异质性与血源供应两大关键问题。从异质性来看，PBMC 含 12% 单核细胞与 88% 淋巴细胞，且来自不同供体，细胞组成、功能状态及热原反应存在明显差异，导致热原刺激后 IL-6 释放量波动大，标准化难度高。血源供应方面，除受献血者数量、时间及采集血液政策限制外，EP2.6.30 还要求严格检测乙肝、丙肝等标志物，且采集血液、处理、试剂制备全程需无菌操作，流程环节多、复杂度高，远不及单核细胞系制备简便，易影响热原检测的时效性与稳定性。安徽热原检测技术升级
