细胞基因治疗产品用宿主细胞蛋白（HCP）残留检测抗体制备

宿主细胞蛋白（HCP）多与细胞关键功能相关，例如细胞增殖、基因转录、蛋白合成修饰、细胞存活及凋亡等，在生产工艺中会因细胞分泌、死亡或裂解而释放。生产过程里，有三大因素主要影响 HCP 的组成与丰度：①宿主细胞基因组调控及培养工艺：特定工艺下，潜在 HCP 数量可能极多，且并非所有基因都会表达，部分基因的表达具有时间和条件特异性；像大肠杆菌约含 4300 个基因，不同工艺产物会经历独特的翻译后修饰，这增加了 HCP 的总数与生化复杂性。研究显示，大肠杆菌表达的蛋白间存在数量差异，这种差异可能是对环境条件的适应性反应，但 85-90% 具有潜在免疫原性的 HCP 在不同发酵过程中均会出现。②产物表达方式：宿主细胞与外源基因、载体及辅助成分构成的体系，可实现稳定、瞬时及诱导表达；以大肠杆菌为例，常见表达形式包括胞内表达、分泌表达、可溶性表达、不溶性包涵体形式，还有融合与非融合表达。③纯化步骤及产品自身特性的影响：纯化过程中能去除 99% 以上的 HCP，但仍有少量残留 HCP 留在产品中，这些残留 HCP 可能与产品结合，随产品一同被纯化。

宿主细胞蛋白（HCP）残留监测是生物药物生产中的关键质量属性（Critical Quality Attribute, CQA），需在药物开发与生产阶段对 HCP 的存在实施严格监控、管理及记录。随着生产流程推进，生物制品目标蛋白纯度逐步提升，HCP 含量则相应持续下降，这导致对单抗、融合蛋白等富含目标蛋白的下游工艺样品进行 HCP 分析监测时，难度明显增加。在此背景下，高效的 HCP 富集材料与技术显得尤为重要。SHENTEK^®AbunProteoX 是基于磁珠构建的亲和配体，能高效识别并结合目标蛋白；借助磁性纳米颗粒的独特特性，它可快速高效捕获 HCP，大幅提升检测灵敏度。此外，该亲和配体的普遍适用性，让 AbunProteoX 处理多种生物样本时表现优异，可确保样品中存在高浓度目标蛋白时，对低浓度 HCP 的质谱、电泳等检测分析具备准确性与可靠性。

昆虫细胞杆状病毒表达系统（IC-BEVS）是一种真核表达系统，以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为宿主实现外源蛋白的生产。该系统具备便于规模化生产、培养成本低、生物安全性高等优势，近年已逐步应用于重组蛋白、rAAV 载体、亚单位疫苗（如病毒样颗粒（VLP）疫苗）等产品的生产，在生物制品重组蛋白表达领域已得到广泛应用。Sf9 细胞系源自草地夜蛾细胞系（Spodoptera frugiperda cell line，简称 Sf），是当前较为常用的昆虫细胞系之一。SHENTEK^® Sf9 HCP 残留蛋白检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法），可对采用 Sf9 细胞系生产的生物制品中宿主细胞蛋白（HCP）残留进行定量检测。该试剂盒的抗体覆盖率分别为 70.4%-96.0%（采用 IMBS-2D 法）和 91.2%（采用 IMBS-MS 法，Unique Peptide ≥2）。

宿主细胞蛋白残留检测中，抗体覆盖率评估实验的操作难度较高，需在实验方法建立阶段对关键步骤开展充分验证，以确保实验方法具备稳健性。湖州申科研发的磁珠捕获式 IMBS 技术（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分离），在开发过程中已对关键步骤进行充分验证，相关验证结果已通过专业评审，具体验证内容（部分）如下：① 方法优化：围绕磁珠与抗体的偶联比例、洗涤液体积、洗涤次数、洗脱次数等关键参数开展优化验证，确保方法稳健性；② 过程质控：二维电泳存在实验步骤繁琐、时间跨度大、中间环节难把控等问题，因此在等电聚焦实验环节引入荧光标记多肽，可快速判定等电聚焦效果；同时在 SDS-PAGE 电泳两侧增设 40 ng 银染质控样品，用于控制银染显色过程；③ 方法重复性：针对 2D 分析与 LC-MS 分析开展重复性验证，其中 2D 分析方法的重复性可达 80% 以上，LC-MS 分析方法的重复性可达 90% 以上；④ 上样量优化：针对 2D 分析与 LC-MS 分析实施上样量验证，规避上样量差异对检测结果的影响；⑤ 假阳性排查：排查样品与阴性抗体间是否存在非特异性结合，确认 IMBS 实验设定的步骤与参数是否会导致假阳性结果。

由于 HCPs 属于复杂的多分析物，为制备覆盖率尽可能高的抗体（以覆盖工艺特有的高风险 HCPs），需采用可靠的免疫策略。获得符合性能要求的抗体后，需借助经过验证的 2D 或 LC-MS 方法对抗体覆盖率进行表征，确保抗体可充分覆盖各实际工艺下产生的 HCPs。在拥有代表性抗原与优良性能抗体的基础上，开展 ELISA 检测体系开发，涵盖原辅料筛选与制备研究、各组分工艺及反应体系研究、稳定性研究等重要内容。检测体系开发完成后，需依据 ICH 及药典要求开展分析方法验证评估，确保体系的线性、范围、检测限、定量限、准确度、精密度、专属性及耐用性均满足法规要求。

各国法规要求对生物药品开展分析与纯化处理，以将宿主细胞蛋白（HCP）降至可接受水平；即便终产品中痕量 HCP 进入患者体内，目前仍不明确特定残留蛋白质杂质是否会对药物的稳定性或免疫原性产生影响。在 HCP 限量标准方面，美国药典推荐终产品 HCP 水平为 1-100 ng/mg；中国药典各论则明确，大肠杆菌（E.coli）菌体 HCP 需不高于蛋白质总量的 0.10%（即 1000 ng/mg），CHO 细胞 HCP 需不高于蛋白质总量的 0.05%（即 500 ng/mg），假单胞菌 HCP 需不高于蛋白质总量的 0.02%（即 200 ng/mg）。