尺寸排阻层析，也称为凝胶过滤，是根据蛋白质流体力学体积（或表观分子量）进行分离的独特方法。其固定相是由高度多孔的惰性颗粒组成。当蛋白质混合物通过层析柱时，大于孔径的蛋白质无法进入颗粒内部，只能从颗粒间的空隙流过，因而较早被洗脱。较小的蛋白质可以进入部分或全部孔径，在柱内停留的路径更长，因而被较晚洗脱。SEC的流动相只用于输送蛋白质，不参与分离过程，因此通常采用等ocratic洗脱（恒定缓冲液成分）。SEC主要用于三个目的：1）脱盐或更换缓冲液；2）估算蛋白质的表观分子量；3）作为精纯步骤，分离蛋白质的单体与聚合体，或分析蛋白质的寡聚状态。其优点是条件温和，能保持蛋白质活性，但分辨率相对较低，且上样量小。高压均质技术可用于蛋白质的细胞破碎提取环节。湖北蛋白分离纯化操作细节
混合模式层析的固定相配体设计为能够同时通过两种或多种不同的相互作用机制与蛋白质结合，例如静电相互作用与疏水相互作用的结合，或氢键与π-π相互作用的结合。这种多重作用机制使得其选择性不同于传统的IEX或HIC，往往能分离用传统方法难以分开的蛋白质。它可以在高盐条件下结合带电荷的蛋白质，这打破了传统IEX的局限。羟基磷灰石层析是经典的混合模式层析，其同时存在Ca²⁺位点（与蛋白质的羧基作用，类似阳离子交换）和PO₄³⁻位点（与蛋白质的氨基作用，并有氢键和金属螯合作用）。混合模式层析为纯化工艺开发提供了新的有力工具。湖北蛋白分离纯化操作细节自动化蛋白分离纯化设备提高了实验效率和安全性。
在获得澄清的细胞提取液后，第一步纯化（常称为粗提或富集）常采用沉淀法。其原理是通过改变溶液条件，大幅降低目标蛋白（或杂蛋白）的溶解度，使其选择性沉淀，从而实现与大量杂质的快速分离。经典的方法是硫酸铵沉淀，通过加入高浓度的硫酸铵，与水分子竞争蛋白质表面的水合层，暴露出疏水区域，导致蛋白质因疏水相互作用而聚集沉淀。不同蛋白质在不同浓度的硫酸铵下开始沉淀，通过控制饱和度可以粗略地分级沉淀蛋白质。其他沉淀方法包括使用有机溶剂（如乙醇）或改变pH至目标蛋白的等电点。沉淀法的优势在于处理量大、快速、成本低，能明显浓缩样品并去除大量杂质，非常适合作为层析前的初始步骤。
纯化得到的宝贵蛋白质需要妥善储存以维持其长期稳定性。储存条件取决于蛋白质的性质。短期储存（数天至数周）可在4°C下进行，并加入抗菌剂（如叠氮钠）。长期储存通常采用冷冻。快速冷冻并在-80°C保存是常用的方法。为了防止冷冻和解冻过程中因冰晶形成、pH变化和相分离造成的变性或聚集，通常需要加入冷冻保护剂，如10-50%的甘油或蔗糖。分装储存是避免反复冻融的关键。对于极不稳定的蛋白质，可能需要冻干（lyophilization）。此外，进行简单的稳定性研究非常有益，即测试蛋白质在不同pH、温度、盐浓度和储存时间下的活性保留情况，从而为其处理与储存提供科学依据。大规模生产中，蛋白纯化需要兼顾效率和成本。
蛋白质分离纯化是生物化学、分子生物学及生物技术领域的主要技术与基础。其根本目的在于，从复杂的生物样本（如细胞、组织或体液）中，特异性地分离出单一的目标蛋白质，并使其达到所需的纯度与活性水平。这一过程对于研究蛋白质的结构、功能、相互作用，以及对于开发诊断试剂、疗愈性抗体和酶制剂等生物制品都至关重要。然而，该过程充满挑战，因为生物样本中通常含有成千上万种不同的蛋白质，以及核酸、多糖、脂类等杂质。目标蛋白可能只占总体蛋白质的极小比例，且其本身可能具有不稳定性，容易在纯化过程中因pH、温度、蛋白酶或机械剪切力等因素而失活或降解。因此，一个成功的纯化策略必须高效、特异，并能较大限度地保持目标蛋白的生物学活性。蛋白分离纯化的原理基于物理、化学及生物特性差异。河南酶蛋白分离纯化
优化缓冲液成分可提高目标蛋白的分离纯化效率。湖北蛋白分离纯化操作细节
冷冻电镜技术，特别是单颗粒分析，对蛋白质样品的单分散性要求极高。样品中必须尽可能避免聚集体、降解产物或构象不均一的存在，否则会严重影响二维分类和三维重构的分辨率。因此，用于冷冻电镜的蛋白质通常需要经过极其精细的纯化（如多次凝胶过滤）和严格的DLS、负染电镜筛选。对于疗愈用蛋白质（尤其是哺乳细胞系统表达的），下游纯化工艺必须具备验证过的病毒清理/灭活能力，这是药品监管的强制要求。特定的纯化步骤，如低pH孵育、去垢剂处理、纳米过滤以及某些层析步骤（如阴离子交换），被证实能有效灭活或去除可能潜在的病毒污染物，确保产品的生物安全性。湖北蛋白分离纯化操作细节
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