免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索比较好浓度。
2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是比较好的时间和次数。若不行，还可高压修复。
3、组织切片本身这种抗原含量低。
4、血清封闭时间过长。
5、DAB孵育时间过短。
6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
7、开始做免疫组化，建议一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等问题。 免疫组化常见问题原因分析！山东病理免疫组化
免疫组化的特点：
1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。
2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。
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免疫组化结果中的假阴性是指所有抗体标记的切片均呈阴性，无阳性信号，假阴性结果不是真实的反应。导致假阴性结果的原因有:(1)抗原修复方法选择不当，根据不同的抗原特点采用不同的修复方法，大多数抗体要求热修复，热修复又包括高压修复、微波修复及煮沸热修复;而对某些细胞内抗原和细胞间质抗原需要用酶消化，如表皮生长因子(EGFR)要求胃蛋白酶(Pepsin)消化，而Vimentin则不用修复;(2)一抗本身的问题:一抗效价降低或失效。在免疫组化中染色结果的假阴性会导致错诊或漏诊，进而影响临床诊断及延误医疗。解决这一问题的可通过设立阳性对照，比较两者染色结果。若阳性对照有表达，表明试剂和染色体系及实验步骤均无问题;若阳性对照无表达，则检测过程中某一试剂或某个步骤存在问题，应逐一查找原因。
免疫组化（IHC）利用抗体检测组织切片中蛋白质和其他抗原的定位。
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抗体-抗原的相互作用通过有色酶底物显色检测或荧光染料荧光检测进行观察。虽然IHC在定量方面不如蛋白质印迹或ELISA，但是IHC可以提供完整组织中蛋白定位的宝贵信息。蛋白表达谱对病理学家以及作为诊断工具都具有重要意义。
IHC实验成功的关键在于稳定、优化且可重复的染色方案，而该方案应使用高质量的特异性试剂。 英瀚斯生物免疫组化，高效高质量出结果。
目前几种常用免疫组化方法简单介绍
1）免疫荧光方法是**早建立的免疫组织化学技术。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
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2）免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前**常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。
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细胞爬片免疫组化检测实验步骤
1、选择贴壁良好的细胞爬片，用4%多聚甲醛固定后15min后自然晾干。
2、PBS洗3次，每次5min。3、切片放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。
4、PBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封闭20min（封闭电荷）。
5、去除BSA液，每张切片加入50μl稀释的一抗覆盖组织，4℃过夜。
6、PBS洗3次，每次5min。
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7、去除PBS液，每张切片加50μl-100μl相应种属的二抗，4℃孵育50min。
8、PBS洗3次，每次5min。
9、去除PBS液，每张切片加50-100μl新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色。
10、显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化（1s），自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
11、切片经过梯度酒精（70-100%）10min一个梯度，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。 山东病理免疫组化
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