加入20μteinaseK溶液,混匀。加入200μL缓冲液GB,充分颠倒混匀,在56℃放置14min(期间颠倒混合样品数次),溶液应变清亮,若未完全变清亮,延长裂解时间至完全变清亮。加人200μL无水乙醇,充分振荡混匀10s,此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱中加入500μLGD(已加入无水乙醇),12,000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱中加入600μLPW(已加入无水乙醇),12,000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱CB3放回收集管中。12,000rpm(~13,400×g)离心2min。将吸附柱放置新的,以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。向吸附柱中悬空滴加50~200μL洗脱缓冲液,室温放置2~5分钟,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中,测定浓度及纯度后,取3μL,加入到配制好的荧光PCR反应液,于ABI7500荧光PCR仪中进行扩增。用本发明和对照产品对8份样本同时进行荧光PCR扩增。结果如图6,本发明所有反应孔背景信号好、Ct值都在21~25之间,荧光扩增曲线呈典型的S型。口腔拭子只能使用一次。辽宁咽拭子口腔拭子供应商

所有反应孔背景信号好、Ct值都在19~25之间,荧光扩增曲线呈典型的S型,说明本发明实例1提供的血液样本快速提取法用于荧光PCR扩增的方法具有较好的可行性。将四份不同来源不同的人血液样本进行荧光PCR扩增检测,每份样本平行三次,结果分别如图2、图3、图4、图5所示,由图可见,每个样本的平行实验,其曲线的Ct值很接近且≤25。说明本发明实例提供的血液样本快速提取法用于荧光PCR扩增的方法有可靠的重复性以及较好的均一性。实施例2与市场现有的血液基因组提取试剂盒产品对比。本发明的具体步骤如下:将**管颠倒混匀后,吸取100μL血液至,加入200μL的核酸释放剂(20mM~80mM的氢氧化钠溶液、~、~、~、~***钠、~3%甲酰胺),涡旋混匀,然后5000g离心30s,弃上清,获得细胞沉淀;然后再加入200μL核酸释放剂,涡旋1min至沉淀完全散开,5000g离心30s,弃上清;向细胞沉淀中加入50μL核酸释放剂,涡旋振荡1min,室温放置5min,12000g离心30s,取上清液即为提取的血液基因组DNA;取上清液3μL,加入到配制好的荧光PCR反应液,于ABI7500荧光PCR仪中进行扩增。选用某公司的血液基因组提取试剂盒作为方法比对,具体操作过程:将取血管颠倒混匀数次,吸取200μL血液于。山东核酸口腔拭子供应商口腔拭子是一个形状长得跟牙刷很像的拭子。

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本发明的特征在于:应用本发明的血液基因组DNA提取方法在10分钟内提取血液基因组可用于荧光PCR扩增检测,主要步骤如下。(1)将**管颠倒混匀后,吸取100μL血液或者吸取100μL口腔拭子样本保存液至,加入200μL的核酸释放剂,涡旋混匀,然后5000g离心30s,弃上清,获得细胞沉淀。(2)将步骤(1)中得到的血液细胞沉淀中再加入200μL核酸释放剂,涡旋振荡1min,至沉淀完全散开,然后5000g离心30s,弃上清。(口腔拭子样本则无需进行此步骤)。(3)向步骤(2)所获得的沉淀中加入50μL核酸释放剂,涡旋振荡1~2min;室温放置5min,12000g离心30s,取上清液即为提取的基因组DNA;所述的核酸释放剂组成为20mM~80mM的氢氧化钠溶液、~、~、~、~***钠、~3%甲酰胺;所述荧光PCR反应液组成为ROX、TaqMan探针、引物、dNTP、dUTP、UDG、BSA、聚合酶及缓冲液。附图说明图1为实例1检测的8份血液样本平行实验的荧光扩增曲线图。图2~图5为实施例1提供的四份血液样本的三次平行实验的荧光扩增曲线图。图6为实施例2对比实例1提供的对8份血液样本平行实验的荧光扩增曲线图。具体实施方式为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案。口腔拭子适用于采集任何年龄段人群的DNA样本。山东尼龙口腔拭子批发厂
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