外泌体分离

外泌体富含蛋白质、脂质和核酸分子，这些分子具有来源细胞的特异性，所以通过分析中流细胞所释放的外泌体分子特征就可部分反映其来源细胞表型及其生物学作用。现已发现多种中流外泌体来源的蛋白类分子标志物。例如，乳腺ai、结肠ai和胰腺ai中均可检测到磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican1，GPC1）的表达，且与乳腺ai和结肠ai相比，GPC1对胰腺ai的早期诊断尤具价值。前列腺ai患者血浆外泌体中凋亡抑制蛋白的表达增高则提示与中流进展相关。随着蛋白组学技术的发展，研究发现中流患者血液外泌体来源的蛋白标志物其诊断特异性和敏感性分别可达到95％和90％。外泌体可以作为生物标志物来对疾病进行检测。外泌体分离

细胞摄取诊疗性外泌体：从树突状细胞、成纤维细胞和间充质细胞中分离出的诊疗性外泌体可对靶细胞产生特定的作用，包括新抗原呈递、免疫调节和药物有效载荷传递。诊疗性外泌体对靶细胞的影响可能是通过不同的进入或相互作用机制来控制的。完整的外泌体的进入可能包括受体介导的内吞作用、网格蛋白包被小凹、脂筏、吞噬作用、小凹和大胞饮作用。外泌体内容物的进入或外泌体信号的诱导可能涉及配体受体诱导的细胞内信号或融合，从而将外泌体内容物沉积到细胞质中。辽宁脑脊液外泌体干细胞外泌体有减少细胞凋亡、促进血管生成、抑制纤维化等重要生物学功能，在调控组织再生方面有好的前景。

目前，提取外泌体的方法主要有超速离心法、PEG沉淀法，但这些方法混有非常多的杂质，必须慎重分析得到的是否是外泌体。超速离心法存在操作繁杂、回收量不稳定，不能用于定量分析、必须使用昂贵的超速离心机、无法进行多样品分析等问题。因此外泌体研究相对困难，需要尽快开发操作简单、可提取高纯度外泌体的技术。因此，日本和光着眼于巨噬细胞的外泌体受体Tim4蛋白，制备Tim4细胞外域与磁珠结合的“Tim4磁珠”。Tim4通过磷酯酰丝氨酸（PS）法特异性结合Tim4蛋白和磁珠，再经过含有EDTA的洗脱缓冲液进行分离，提取高纯度的完整外泌体。

为了解决外泌体实验遇到的上述的各种问题,Wako研发出MagCapture™外泌体提取试剂盒PS（MagCapture™ExosomeIsolationKitPS）提取高纯度细胞外囊泡。外泌体膜含有分泌细胞源的蛋白和脂质，众所周知磷脂酰丝氨酸（PS）在活细胞通过翻转酶作用导向细胞膜内侧，暴露在外泌体膜外侧3）。另外，T-cellimmunoglobulindomainandmucindomain-containingprotein4（Tim4通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体）蛋白通过细胞外域IgV域与含有钙离子的PS结合4）。基于上述知识，我们利用Tim4固化磁珠，在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体，再添加螯合剂洗脱外泌体，这种外泌体纯化方法是和金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发，并取得了成功。5）这是迄今为止取代黄金标准超速离心法的新型外泌体纯化方法。外泌体的异质性决定了外泌体药物递送系统要根据所传递治理物质的类型、目标组织的特点等进行针对性的调整。

被特定部位的细胞获取的瘤子外泌体可为肿细胞的转移准备转移前微环境。用肺转倾向的肿细胞细胞来源的外泌体处理小鼠后可使骨转倾向的肿细胞细胞重新定向。外泌体的蛋白质组学分析发现不同部位倾向性的肿细胞细胞来源的外泌体具有不同的整合素（integrin）表达谱，整合素α6β4和α6β1与肺转有关，而整合素αvβ5与肝转有关。敲低整合素α6β4和αvβ5可减少外泌体被靶部位细胞获取，进而分别降低了肺和肝的转移。进一步研究发现外泌体整合素被细胞获取后活跃了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表达。通过临床数据分析显示外泌体整合素可作为预测肿细胞转移的部位倾向性的诊断指标。外泌体的提取的方式：PS亲和法。免疫印迹或蛋白质印迹是分析外泌体较常用的方法之一，其原理是外泌体上特异性抗原与抗体结合。体液外泌体脂质组学

在研究和评估外泌体的副作用和功效时，必须考虑到肉瘤细胞来源的外泌体可能增强肉瘤生长的潜在风险。外泌体分离

外泌体作为细胞外囊泡的一个亚群,直径集中于30~150nm。目前,基于粒径大小分离外泌体的方法有超滤法、尺寸排除色谱法、静水过滤透析法和非对称场流分离法等。超滤法利用不同孔径的滤膜,对样品进行选择性分离以获得外泌体,一般分为压力超滤和离心超滤。其中离心超滤效果更好,不jin能减轻力对外泌体的破坏,而且可通过增大离心力和延长离心时间提高外泌体产物浓度。但离心力过大或离心时间过长均有可能导致超滤膜或外泌体破裂。此外,超滤法可以和切向流过滤法、微控流法、超速离心法或凝胶过滤色谱法等方法结合进一步提高分离效率。外泌体分离

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