黄石透射电子显微镜技术服务中心

冷冻电镜技术原理之电子晶体学：利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构(晶体)成像或者收集衍射图样，进而解析这些生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。其适合的样品分子量范围为10~500kD，Zgao分辨率约0.19nm。该方法与X射线晶体学的类似之处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图像来进行结构解析。冷冻电镜技术之冷冻蚀刻电子显微镜优点：能耐受电子束轰击和长期保存。黄石透射电子显微镜技术服务中心

冷冻电镜技术的原理：冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的中心是透射电镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤。在透射电镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜内部运动，根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理，透射电镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，Z后在记录介质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。金华快速冷冻显微镜技术冷冻电镜技术能够从分子层面进行详细的研究，解析基于结构的药物研发的分子基础。

冷冻电子显微镜技术中电子断层扫描重构技术：电子断层扫描技术是从一个物体的投影图像重构获得物体内部结构的技术，通过获取同一物体的多个连续角度下的二维投影图来反向重构它的三维结构。简单地说，电子断层扫描技术就是将一个物体(样品)沿着一个与电子束垂直的轴旋转，每旋转一个角度，采集这个物体在相对应方向上的二维投影像，通过对这些二维投影图的处理(相互配准)，将不同角度的二维投影图反向重构(如加权背投影等方法)，获得样品整体三维结构的技术。电子断层成像适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。与电子晶体学和单颗粒技术相比，这种技术无需样品颗粒具有结构同一性，也不强调样品具有一定的对称性。因此，虽然目前电子断层成像所获得的结构的分辨率(约4~10纳米)不能与以上两种技术相比，但其在研究非定形、不对称和不具全同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的作用。

冷冻电镜技术解析结构的一般流程是怎样的？对样品的要求是什么？冷冻电镜解析蛋白结构一般流程为：蛋白表达纯化；负染样品准备：约2小时完成；负染样品的数据收集：约8小时完成；冷冻样品的准备：约4小时完成；冷冻样品的数据收集：48-120小时完成。三维结构重建。冷冻电镜解析蛋白结构对蛋白质的要求：分子量：一般需要样品的分子量在200kD以上。缓冲液：缓冲液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有机物质，这些会降低样品的衬度，难以获得高分辨的三维结构。一般而言，缓冲液为20mMHepes，150mMNaCl。浓度：一般而言，可溶性蛋白浓度应在1mg/ml左右，膜蛋白应保证浓度在5mg/ml左右。体积：20ul足够（前提是需要蛋白浓度达标，做一个样品3ul左右）。均一性：分子筛行为表现为单一的峰，均一性大于90%。虽然冷冻电镜技术属于前沿技术，但目前已经有利用冷冻电镜基于结构研发的药物进入临床试验。

冷冻电镜技术的原理：透射电镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968年，AronKlug发现ZX截面定理，提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理，利用透射电镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。冷冻电镜技术将生物分子进行冷冻便可进行高分辨率成像，还具有分辨率高等优势。苏州生物冷冻透射电子显微镜技术应用

冷冻电镜技术之冷冻蚀刻电子显微镜优点：冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜具有很强的立体感。黄石透射电子显微镜技术服务中心

冷冻电镜技术原理之单颗粒技术：对分散分布的生物大分子分别成像，基于分子结构同一性的假设，对多个图像进行统计分析，并通过对正、加和平均等图像操作手段提高信噪比，进一步确认二维图像之间的空间投影关系后经过三维重构获得生物大分子的三维结构方法。其适合的样品分子量范围为80~50MD，Zgao分辨率约0.3nm。利用单颗粒技术获得三维重构的方法主要包括等价线方法、随机圆锥重构法、随机初始模型迭代收敛重构等方法，其基本目标是获得二维图像之间正确的空间投影关系，从而进行三维重构。黄石透射电子显微镜技术服务中心

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